세포 사멸 실험/Cell viability assay

세포의 증식 또는 사멸도를 평가하는 실험은 생명과학 분야에서 필수적인 실험 중의 하나이다.

Cell viability assay는 세포의 대사 혹은 세포 내에 존재하는 효소들의 활성과 관련된 약물을 세포에 처리한 후, 세포 독성 및 세포 수의 변화를 확인하는 실험법이다.

 

살아있는 세포를 측정하는 가장 직접적인 방법은 세포에 trypan blue 등을 처리하여 염색한 후 현미경과 hematocytomerer를 이용하여 생존세포수를 측정하는 방법이다.

하지만 검체 수가 많을 시에는 측정시간과 노력이 많이 소요되고, 부정확한 결과를 가지고 올 수 있어 직접적인 방법을 사용하기 어렵기 때문에 이를 대체하기 위한 여러가지 방법이 개발되고 있다. 

 

대표적인 방법으로 MTT assay, XTT assay, WST1 assay 등이 있다.

 

1)    MTT assay

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

Tetrazolium salt는 3개의 aromatic ring이 연결된 heterocyclic compound이다.

Tetrazolium salt의 한 종류인 MTT를 처리하면 mitochondria 내의 reductase에 의해 환원되어 발색을 나타낸다.

살아있는 세포(Live cell)에 MTT를 처리하면 mitochondria 내의 reductase에 의해 환원되어 보라색을 띄는 formazan이 형성된다.

죽은 세포(dead cell)라면, mitochondria가 이미 죽어 없으므로, formazan이 형성되지 않는다.

이렇게 생성된 formazan은 비수용성으로 유기용매 (예. Dimethyl sulfoxide, DMSO)로 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정한다. 

Formazan이 형성이 많을수록 진한 보라색을 띈다. 

 

실험 방법

세포 seeding (96 well plate 등) 후 실험 조건에 맞게 실험 셋팅. (예. 약물처리 등)

Treatment with MTT reagent for 2 - 4 h

Treatment with solvent (ex. DMSO)

Absorbance analysis at 570 nm

  

MTT assay의 활용

• Quantification of cell growth and viability.
• Measurement of cell proliferation in response to growth factors, cytokines and nutrients.
• Measurement of cytotoxicity. Examples are the quantification of tumor necrosis factor-a or -b effects or macrophage induced cell death15,16 and the assessment of cytotoxic 17-34 or growth inhibiting agents such as inhibitory antibodies.
• To study cell activation.

 

 

MTT assay를 활용한 실험 예시.

목적: Farnesyl transferase inhibitor FTI-277에 의한 유방암 세포 생존률 평가

방법

1) 96 well plate에 세포를 5*10^3개씩 seeding 한 후 37도 incubator에서 24 h 배양한다.

2) 약물 FTI-277을 시간별, 농도별로 처리한다.

3) 5 mg/mL MTT 시약을 25 uL씩 첨가한 후 3 h incubation한다.

4) 보라색으로 Formazan이 형성되면 media를 제거 후 100 uL DMSO로 용해시킨다.

5) 570 nm에서 흡광도를 측정한다.

References. Oncol Lett. 2016 Sep;12(3):2222-2226.

 

 

MTT assay는 cell viability를 측정하는 가장 기본적이고, 정확 간편한 실험법이지만, 비수용성인 formazan을 생성하기 때문에, 이를 유기용매 등으로 녹이는 step이 들어간다. 이때, 유기용매를 처리하기 위해, media를 제거하는 과정에서 cell이 손실될 risk가 있다. 또한 대사활성이 낮은 세포의 경우에는 high density의 세포가 필요하다.

이러한 단점을 보완하기 위해 MTT의 변형 물질인 XTT나 WST1등을 사용할 수 있다.

 

XTT/WST1 assay

XTT, WST1은 수용성 tetrazolium salt이다. 따라서 유기용매 처리가 필요하지 않고 media를 제거 할 필요도 없다. 그렇기 때문에, MTT assay에 비해세포 손실 위험도가 적다.

	MTT	XTT	WST1
Solubility	++	+	+++
Sensitivity	+	++	+++
Wavelength	570 nm	450 nm	450 nm